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禽.流感病毒H7N9亞型檢測試劑盒（雙色實時熒光PCR法）
【包裝規格】 25頭份/盒 & 50頭份/盒
【預期用途】
禽流.感病毒H7N9亞型檢測試劑盒（雙色實時熒光PCR法）利用實時熒光PCR原理，定性檢測禽.流感病毒H7N9亞型（AIV-H7N9），對AIV-H7N9引起的禽.流感的診斷和監控具有重要指導意義。
【檢驗原理】
禽流.感病毒H7N9亞型檢測試劑盒（雙色實時熒光PCR法）針對AIV-H7N9高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含AIV-H7N9基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。
注：陰性對照為禽類基因組DNA，陽性對照為失去活性的AIV-H7N9病毒cDNA。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融,有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：
咽喉拭子，采取時要將拭子深入喉頭及上顎裂來回刮3次～5次，取咽喉分泌液；將咽喉拭子放人盛有1.0mL生理鹽水的離心管中備用，應避免標本間交叉污染。
2.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過 夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃，避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
單反液配制表(每頭份) | RT-PCR反應液 | 15.0 μL |
逆轉錄酶 | 2.0 μL | |
Taq酶 | 3.0 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。
根據需要，在上述準備好的PCR反應管中分別加入陰性對照品以及陽性對照品各5 μl，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區）
（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 AIV-H7熒光信號 HEX通道采集 AIV-N9熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環數 |
反轉錄 | 42℃：10分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。
2.標本結果判定：
（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結果的解釋】
通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 | |
FAM | HEX | |
+ | + | 樣本中檢測出AIV-H7和AIV-N9 |
+ | - | 樣本中檢測出AIV-H7，未檢測出AIV-N9 |
- | + | 檢測出AIV-N9，未檢測出AIV-H7。 |
- | - | 未檢測出AIV-H7和AIV-N9。 |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的*檢出*可能會發生假陰性的結果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產生假陰性結果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發生交叉污染，則容易得到假陽性結果。
【產品性能指標】 產品的*檢出限為102 Copies/mL，產品CV值≤5%。
【注意事項】
1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進行操作，各區實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區應該配有紫外線殺菌裝置。
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理。
3. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。
5. 試劑盒內所配陰性和陽性對照在第1次使用前應全部轉移至標本準備區，并單獨存放。
6. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
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